La culture in vitro

Nous allons voir comment marche le clonage par culture in vitro, et les différentes étapes de cette technique.

Le clonage Le clonage peut être naturel ou artificiel. C’est une reproduction asexué, la multplication d’un être vivant, avec conservation du même génome. Dans le monde végétal, le clonage n'est pas un phénomène sensationnel car les boutures, le marcottage, ... sont toutes des manières de produire des exemplaires d'une même espèce à base d'une seule cellule. Mais ceci est le clonage naturel. Le clonage végétal artificiel, c’est à dire principalement la culture in vitro, n’est pas aussi banal! Le terme de in vitro indique que les cellules en cultures sont entourées par du matériel de laboratoire. Cette technique vise à régénérer des plantes entières à partir de cellules ou de tissus végétaux mis en culture dans des milieux nutritifs spécifiques, dans des conditions stériles, un espace réduit, et un environnement contrôlé (la température, l’éclairage,...). Lorsque des cellules ou un groupe de cellules de plantes sont placées hors de leur environnement normal, et sont maintenues en vie, on parle de mise en culture in vitro. De plus cette technique peut être utilisé à tout moment de l’année puisque les cultures ont un espace très contrôlé, il n’y a pas besoin de se soucier des saisons.

La totipotence Pourquoi se limiter à la culture in vitro de plantes? C’est parce que seules les plantes ont une caractéristique, qui est nécessaire pour la culture in vitro. C’est la totipotence. La différenciation cellulaire est un concept décrivant le processus par lequel les cellules se spécialisent en un «type» cellulaire. La morphologie d'une cellule peut changer, mais le matériel génétique reste le même, à quelques exceptions près. Une cellule capable de se différencier en plusieurs types de cellules est appelé pluripotente. Ces cellules se retrouvent par exemple chez les humains, les animaux,... Une cellule capable de se différencier en tous les types cellulaires d'un organisme est dite totipotente. Et les cellules totipotentes sont très présentes chez les végétaux, et sont présentes seulement au stade embryonnaire chez les animaux. Donc, la totipotence,c’est la capacité d’une cellule à se dédifférencier en n’importe quelle autre cellule spécialisée. Cette différenciation ne peut se réaliser qu’avec la présence d’une hormone végétale; l’auxine. Elle joue un rôle majeur dans le contrôle de la croissance et du développement des plantes.L'auxine est synthétisée principalement dans les jeunes feuilles et est activement transportée vers les autres tissus de la plante. Ainsi à partir de n’importe quelle cellule on peut recréer un clone de la plante mère. Les tissus sont développés en divisant les cellules par mitose. La mitose permet la répartition égale des chromosomes dans les cellules filles. Elle est composée de plusieurs étapes :

1. La prophase
2. La métaphase
3. L’anaphase
4. La télophase

Lors de la première phase de l'interphase, le matériel génétique est sous la forme de chromosomes décondensés et simples. Chaque chromatides contient une molécule d’ADN doubles brins. Pendant la seconde phase, aussi appelé synthèse, la quantité d’ADN double progressivement. À la fin de cette phase le matériel génétique est sous la forme de chromosomes décondensés doubles, donc à deux chromatides. À la troisième phase, la cellule se prépare à la mitose. Lors de la prophase l’ADN se condense en chromosomes, il est alors visible. Il y a également disparition de l’enveloppe nucléaire, les chromosomes se dispersent alors dans le cytoplasme de la cellule. La métaphase est le moment où les chromosomes migrent vers l’équateur de la cellule, les centromères des chromosomes s’alignent sur le même plan équatoriale, les chromosomes forment alors une plaque équatoriale. C'est à ce moment que les chromosomes sont compactés au maximum et que l’on peut réaliser les caryotypes. Lors de l’anaphase, il y a rupture du centromère et les chromatides de chaque chromosomes doubles se séparent. Ensuite deux lots identiques de chromosomes simples migrent vers les pôles opposés de la cellule. Lors de la télophase, la cellule mère se coupe en deux et donne naissance à deux cellules filles qui ont exactement le même équipement génétique que la mère. Et une enveloppe nucléaire se reforme autour du matériel génétique dans les deux cellules. La mitose est alors terminé.

Les techniques de la culture in vitro Micropropagation La micropropagation, également appelé le microbouturage, est une technique très utilisée dans le monde pour multiplier rapidement et en grand nombre des plantes dont la reproduction naturelle peut être difficile. Cette technique permet la production de nombreux clones parfaitement sains. Des tissus végétaux sont développés pour donner des plantes identiques à la plante mère. Cette technique est basé sur la totipotence chez la plante. Culture des méristèmes Le méristème c’est le tissu cellulaire de la plante spécialisé dans la croissance. La particularité des cellules se trouvant dans le méristème c'est qu’elles sont totipotentes en permanence. La culture des méristèmes permet d’obtenir un clone parfait de la plante d’origine et il sera parfaitement sain, car ce tissu cellulaire est indemne de tout virus même chez des plantes malades. Le méristème se trouve dans le cœur d’un bourgeon ou à l’extrémité des racines. Grâce à cette méthode on peut assurer la sauvegarde de variétés menacées par un virus. Embryogenèse somatique L’embryogenèse somatique est une technique apparue après la découverte de l'auxine en 1926 par le scientifique Went. Elle permet d’obtenir des plantules, c’est à dire le stade de la plante après l’embryon, génétiquement identiques à la plante mère. On trouve dans une graine l’embryon à prélever. Cette technique fait appel à la notion de totipotence car on génère un embryon végétal à partir d’un cal, c'est à dire un amas de cellules indifférenciées. La technique consiste à provoquer l’apparition de tissus végétaux ce qui provoque de nombreuses divisions cellulaires dans les cals, créés grâce à la totipotence de la cellule, ce sont ces cals qui vont créer par la suite une plante entière. Ces divisions cellulaires sont provoqué par deux hormones végétales : l’auxine 2,4D (une auxine de synthèse) et la cytokinine. L’auxine de synthèse est perçu par la plante comme une auxine naturelle mais elle n’est pas dégradé par la plante, il y a donc une accumulation dans le milieu qui provoque un choc auxinique, ce choc auxinique va transformer le cal primaire (qui est dans l’incapacité à générer des plantes) en un cal embryogène qui peut régénérer des plantes entière. Le cal obtenue est découpé en plusieurs morceaux pour augmenter la taille de la population qui va se développer. La cytokinine est une hormone de la plante pour la croissance. Le milieu utilisé pour cette technique d’embryogenèse somatique est très spécifique à la technique, il est appelé le milieu de Murashige et Skoog. Ce milieu contient des éléments minéraux : les macro-éléments dont les principaux sont l’azote, le calcium, le potassium, le soufre, le magnésium et le phosphore; les micro-éléments dont les principaux sont le fer, le zinc, le cuivre, le chlore, le bore, le nickel. Il contient également des éléments organiques comme un sucre, le saccharose, des vitamines B, et des acides aminés. Haplodiploïdisation Le processus de haplodiploïdisation c’est l’obtention de plantes haploïdes. Les plantes haploïdes sont issues d’une seule cellule reproductrice appelée gamétophyte mâle ou femelle, sans fécondation. Les plantes obtenues n’ont qu’un seul lot de chromosomes, ils sont donc doublés artificiellement ou naturellement afin que les plantes deviennent fertiles. Les chromosomes peuvent être doublés artificiellement grâce à un agent chimique, la colchicine, issue de la colchique, une plante toxique. La colchicine bloque la mitose après l’interphase, on obtient donc le double de chromosomes identiques et la plante retrouve ses 23 paires de chromosomes au lieu de n’avoir qu’un seul chromosome. Si la plante est obtenue par une gamétophyte femelle on appelle cette technique la gynogenèse, lorsque c’est à partir d’une gamétophyte mâle c'est l'androgenèse.

Les étapes de la culture in vitro Prélèvement Le choix de l’explant à prélever est particulièrement important. Pour chaque espèce, sont pris en compte : la technique de propagation envisagée, la date du prélèvement, l’âge du pied mère, la nature, la taille ainsi que la localisation de l’explant sur le pied mère. Mise en culture in vitro Les explants, sont ensuite désinfectés, travaillés sous conditions aseptiques, puis placés sur un milieu de croissance stérile. Ce support comprend des aliments: sucre; vitamines; régulateurs de croissances (on retrouve de l’auxine, et de la cytokinines) . La composition change selon l’espèce mise en culture. Multiplication Un contrôle rigoureux de l’environnement est nécessaire à la bonne croissance des vitroplants en milieu artificiel. Les paramètres de l’hygrométrie (humidité de l’air), de la température et de la luminosité doivent être adaptés à chaque espèce travaillée. Après, comme expliqué avant, c’est la totipotence qui remplira son rôle! Acclimatation Passer les jeunes vitroplants des chambres de laboratoire climatisées en serres nécessite une étape intermédiaire de quelques semaines pendant laquelle la plante développe son système racinaire. Cette phase d’acclimatation se déroule dans des locaux spécifiques permettant un contrôle précis des conditions d’éclairage, de température et surtout d'humidité. C'est une phase très critique: les plantes peuvent sécher très rapidement puisque en laboratoire elles ont toujours leur spores ouverts permettant les échanges entre la vapeur d’eau et le CO2 entre la plante et son environnement. Les plantes ne savent plus les fermer et peuvent ainsi se déshydrater si le changement est trop brutal. Des précautions sont donc prises : Les tubes où se trouvent les plantes doivent être ouvert pendant deux jours. Les plantes sont ensuite sorties de leur milieux de culture, les racines sont nettoyées, puis elles sont mises en terre. Les plantes enracinées sont ensuite placées dans un substrat composé de 50% de sable, et 50% de vermiculite, un minéral naturel. Élevage Après acclimatation, les plants sont rempotés et conduits sous serres d’élevage pendant quelques mois. Ils sont alimentés et font toujours l’objet d’une surveillance quotidienne. À l’issue de cette période d’élevage, la plupart des plants sont enfin commercialisés.